Исследовано влияние пищевых волокон (ПВ) пшеничных отрубей на апоптоз гепатоцитов крыс при полноценном питании и в условиях поливитаминной алиментарной недостаточности. 48 крыс самцов Вистар (исходная масса тела - 58,1±0,5 г) были рандомизированно разделены на 6 групп, которые в течение 4-х недель потребляли полноценный полусинтетический рацион, содержащий 100% или 20% витаминной смеси без добавления или с дополнительным введением ПВ в дозе, соответствующей верхнему допустимому уровню их потребления (5% от массы корма). 1-я группа животных получала 100% витаминной смеси (Вит); 2-я группа - 100% Вит + ПВ; 3-я группа - 20% Вит (из витаминной смеси были исключены витамины Е, В1 и В2); 4-я группа - 20% Вит + ПВ. В последующие 5 дней в рационы крыс из групп с алиментарным полигиповитаминозом добавили витаминную смесь в количестве 80% от содержания в рационе контрольной группы: 5-я группа - 20% Вит + 80% Вит; 6-я группа - 20% Вит + ПВ + 80% Вит. Суспензию гепатоцитов получали механической гомогенизацией с помощью автоматической системы "BD Medimachine" (Becton Dickenson and Company, США). Апоптоз гепатоцитов оценивали методом проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре "FC-500" (Beckman Coulter, США) после окрашивания клеток конъюгированным с флуорохромом (FITC) аннексином V и витальным красителем 7-аминоактиномицином (Beckman Coulter, USA). У крыс, потреблявших полноценный полусинтетический рацион, обогащенный ПВ (100% Вит + ПВ), величина апоптоза гепатоцитов превышала на 22% (p<0,10) данный показатель у крыс контрольной группы (4,99±1,82% на 10 000 просчитанных объектов). У крыс, находившихся на витаминдефицитных рационах (группы: 20% Вит и 20% Вит + ПВ) апоптоз гепатоцитов статистически достоверно (p<0,05) превышал данный показатель у крыс контрольной группы, составив соответственно 7,03±1,74 и 7,26±1,13%. Нормализация содержания витаминов в рационах крыс дефицитных групп в течение последующих 5 дней не оказала существенного влияния на выраженность апоптоза гепатоцитов у крыс независимо от наличия (8,02±2,18%) или отсутствия обогащения рациона ПВ (8,04+1,66%). На основании полученных результатов можно предположить, что алиментарная поливитаминная недостаточность играет патогенетическую роль в инициации апоптоза гепатоцитов. Добавление ПВ в дозе, соответствующей верхнему допустимому уровню потребления, на фоне адекватного содержания в рационе витаминов, сопровождается тенденцией к развитию апоптоза гепатоцитов, что может быть результатом как прямого действия образующихся из ПВ короткоцепочечных жирных кислот, так и ухудшения обеспеченности организма витаминами.
Апоптоз - физиологический процесс генетически запрограммированной гибели клетки с характерными морфологическими и биохимическими признаками [1, 11, 14]. Апоптоз обеспечивает тканевый гомеостаз и регулирует объем тканей, уравновешивая их новообразование. Различные патологические процессы, активирующие проапоптозные механизмы, заканчиваются гибелью клеток и деструкцией ткани. Результаты исследований в этой области нашли свое отражение в ряде монографий и оригинальных статей [3, 4, 8, 16, 33]. Инициируют апоптоз многие факторы. Сигналами к запуску апоптоза могут быть рецепторные или внутриклеточные (нерецепторные). Нерецепторными сигналами к апоптозу являются изменение потенциала и дестабилизация мембраны митохондрий с помощью проапоптогенных белков семейства Вcl-2 (Bax, Bcl-xs, Bid и др.) или белка р53, который контролирует клеточный цикл и активируется при его нарушении [35]. Ключевыми факторами, индуцирующими проапоптогенные белки, являются изменение оксидантного статуса клетки, образование реактивных форм кислорода и нарушение процессов активации клетки [10, 31, 38], что может быть следствием, в частности, недостаточности витаминов-антиоксидантов. Так, у больных гепатитом В обнаружена прямая корреляционная взаимосвязь между низкими уровнями сывороточного содержания витамина Е и высокой степенью апоптоза гепатоцитов [25]. В то же время антиоксидантные свойства витамина Е используются для ингибирования пролиферации опухолевых клеток и инициации их апоптоза [17, 34]. На клеточных культурах миоцитов показана положительная роль витамина Е в восстановлении целостности клеточной мембраны после окислительного стресса [32].
Недостаточность тиамина описана при синдроме Вернике-Корсакова. Авторы [29] выделили 3 основные механизма проявления тиаминовой недостаточности: окислительный стресс, глутамат-индуцированная цитотоксичность и воспаление. Окислительный стресс при тиаминовой недостаточности происходит вследствие повышенной экспрессии гемоксигеназы (НО-1) и ICAM-1 [27]. Ингибиторный эффект оксида азота на активность цитохром С-оксидазы был установлен как на изолированных митохондриях, так и в клеточной культуре нейронов [19]. Предполагается, что при тиаминовой недостаточности нарушение функции митохондрий и их повреждение играют основную роль в патогенезе гибели нейронов. Для недостаточности витамина В1 характерно возникновение сердечно-сосудистых нарушений [22, 24, 28], развивающихся вследствие системного ацидоза, повышенного образования свободных радикалов и липидной пероксидации, которые инициируют апоптоз клеток. Установлена положительная корреляция между ацидозом и апоптозом кардиомиоцитов [46].
Однако не всегда гибель клеток при витаминной недостаточности происходит путем апоптоза. В исследованиях in vitro в культурах лейкемических T-клеток (Jurkat) и мышиных эмбриональных фибробластов было установлено, что при дефиците витамина А происходит гибель клеток, которая не является следствием апоптоза, несмотря на деполимеризацию мембран митохондрий, увеличение их проницаемости и высвобождение цитохрома С [20]. Авторы установили, что при недостаточности витамина А происходит повышенная продукция активных форм кислорода, значительное снижение уровней АТФ и НАД+ и активация поли-(АДФ-рибозы) полимеразы (PARP)-1, которая участвует в регуляции транскрипционных факторов, активности клеточного цикла и клеточной гибели [39]. Витамину А отводится регуляторная роль в митохондриальном энергетическом гомеостазе. Установлено, что механизмы PARP-1-индуцированной клеточной гибели связаны с энергетической недостаточностью вследствие быстрой утилизации НАД+ и АТФ, транскрипционных нарушений и PAR-ассоциированных сигнальных путей в митохондриях [21, 26, 30, 47].
В инициации апоптоза гепатоцитов нельзя исключать и влияние короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), образующихся в толстой кишке при ферментации пищевых волокон (ПВ) кишечной микрофлорой. КЦЖК преимущественно представлены уксусной, пропионовой и масляной [40, 41]. В ряде исследований установлено, что бутират и в нормальных, и в опухолевых клетках влияет на клеточную дифференцировку, изменяет экспрессию генов, ингибирует клеточную пролиферацию и инициирует апоптоз [18, 44]. Механизмы, посредством которых бутират индуцирует апоптоз в различных типах клеток, не известен, но существуют доказательства, что в некоторых видах опухолевых клеток апоптоз индуцируется путем активации каспаз [36, 37, 42, 43]. На культуре опухолевых клеток кишечника линии НСТ116 и SW480 показано индуцирующее действие КЦЖК на апоптоз путем активации процесса аутофагии митохондрий [45].
Целью исследования явилось сравнительное изучение апоптоза гепатоцитов крыс, находившихся на полноценном питании, в условиях поливитаминной алиментарной недостаточности и обогащения рационов пищевыми волокнами.
Материал и методы
Исследование выполнено на 48 самцах крыс-отъемышей Вистар с исходной массой тела 58,1±0,5 г (49,0-66,5 г). Исследование включало 2 последовательных этапа продолжительностью 30 и 5 дней [12]. Животные были разделены на 6 групп (по 8 крыс в каждой группе).
Животные 1-й контрольной группы (стандартный рацион, 100% витаминов) в течение всего эксперимента (35 дней) получали полноценный полусинтетический рацион, содержащий 20% казеина, 63% кукурузного крахмала, 4,5% рафинированного дезодорированного, вымороженного подсолнечного масла, 4,5% лярда, 3,5% солевой смеси, 1% смеси витаминов [5], 0,3% L-цистеина, 0,25% холина битартрата, 2% микрокристаллической целлюлозы. Содержание витаминов в рационе соответствовало адекватному уровню их потребления для крыс.
К аналогичному по составу рациону животных 2-й группы (100% витаминов + ПВ) в течение всего эксперимента добавляли пшеничные отруби в количестве 5% от массы рациона (или 735 мг на 1 крысу в сутки) за счет уменьшения доли крахмала. Внесение отрубей незначительно увеличивало содержание в рационе витаминов В2 и В1 (2,2-6,5% от содержания в корме животных контрольной группы).
У животных 3-й (20% витаминов), 4-й (20% витаминов + ПВ), 5-й и 6-й групп в течение 30 дней создавали алиментарный полигиповитаминоз путем уменьшения в 5 раз количества добавляемой в рацион витаминной смеси и полного исключения из нее ацетата dl-α-токоферола, тиамина и рибофлавина. Поступление этих витаминов в количестве 19-39% от нормального содержания в корме обеспечивалось за счет естественного содержания в натуральных компонентах рациона (подсолнечное масло, казеин). Крысам 4-й и 6-й групп на фоне дефицитного по всем витаминам рациона добавляли отруби в количестве 5% от массы рациона.
На втором этапе исследования продолжительностью 5 дней крысы 3-й (20% витаминов) и 4-й групп (20% витаминов + ПВ) продолжали получать дефицитный по витаминам рацион без добавления или с добавлением отрубей. Животным 5-й группы (20% витаминов + 80% витаминов) и 6-й группы (20% витаминов + ПВ + 80% витаминов) в течение этого этапа добавляли в корм витаминную смесь в количестве 80% от дозы витаминной смеси в рационе контрольной группы.
На протяжении всего эксперимента крысы 4-й и 6-й групп получали отруби в том же количестве, что и животные 2-й группы.
Животные получали корм ad libitum и имели постоянный доступ к воде. Наблюдение за состоянием животных и поедаемостью корма проводили ежедневно, массу тела определяли еженедельно. По окончании эксперимента предварительно анестизированных эфиром животных умерщвляли путем декапитации.
Суспензию гепатоцитов получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани "BD Medimachine" ("Becton Dickenson and Company", США). Однократно отмывали клетки забуференным фосфатами 0,15 М раствором хлорида натрия, рН 7,2-7,4 (PBS) и готовили пробу с концентрацией клеток 1´106/см3. Окрашивание гепатоцитов производили конъюгированным с флуорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD) с последующей детекцией на проточном цитофлуориметре "FC-500" ("Beckman Coulter", США). Иссеченные кусочки печени и клеточную суспензию в процессе работы хранили на льду. Результаты представлены в виде процентного соотношения живых клеток и гепатоцитов, находящихся на разных стадиях апоптоза, на 10 000 просчитанных объектов в каждом образце.
Содержание в печени витамина А (пальмитата ретинола) и Е (альфа-токоферола) определяли методом высокоэффективной жидкостной хромотографии (ВЭЖХ) [9, 15], витаминов В1 и В2 - флуориметрически [6, 9].
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics Version 20. Результаты представлены в виде средних величин (М), стандартного отклонения (σ) и стандартной ошибки средней величины (m). Оценка достоверности различий средних величин проведена с использованием t-критерия Стьюдента. Уровень значимости считали достоверным при р<0,05.
Результаты и обсуждение
В интактных клетках фосфолипиды плазматической мембраны отличаются асимметричным распределением: фосфатидилхолин и сфингомиелин расположены на наружной поверхности липидного бислоя, в то время как фосфатидилсерин локализован на его внутренней поверхности. На ранних стадиях апоптоза целостность клеточной мембраны сохраняется, но происходит конверсия мембранных фосфолипидов с появлением фосфатидилсерина на поверхности клетки. Аннексин V с высоким сродством связывается с фосфатидилсерином и тем самым маркирует ранний апоптоз в AnV-FITC+ (позитивных)/7-AAD- (негативных) клетках [23]. Это приводит к росту относительного содержания гепатоцитов в состоянии апоптоза и, соответственно, снижению относительного содержания неапоптозных клеток. Комбинированная окраска аннексин V-FITC и 7 ААD позволяет идентифицировать неапоптозные клетки (при сочетании аннексин V-негативные/7 ААD-негативные), ранние проапоптотические изменения (при сочетании аннексин V-позитивные/7 ААD-негативные) и поздние варианты клеточной гибели (7 ААD-позитивные клетки).
Результаты исследования апоптоза гепатоцитов у крыс, находившихся на полноценном и дефицитном по витаминам рационах в условиях обогащения рационов ПВ и компенсации витаминной недостаточности, представлены в табл. 1.
Таблица 1. Апоптоз гепатоцитов экспериментальных животных, %
| Статистические параметры | Неапоптозные клетки | Ранний апоптоз | Поздний апоптоз | Сумма клеток в апоптозе | Мертвые клетки |
| 1-я группа - контроль (100% витаминов) |
| M | 94,76 | 4,47 | 0,51 | 4,99 | 0,24 |
| σ | 1,72 | 1,48 | 0,57 | 1,82 | 0,28 |
| m | 0,65 | 0,56 | 0,22 | 0,69 | 0,10 |
| 2-я группа (100% витаминов + ПВ) |
| M | 93,46 | 5,87 | 0,51 | 6,39 | 0,16 |
| σ | 1,59 | 1,50 | 0,31 | 1,63 | 0,13 |
| m | 0,60 | 0,57 | 0,12 | 0,62 | 0,05 |
| р2-1 | 0,16 | 0,10 | 1 | 0,15 | 0,47 |
| 3-я группа (20% витаминов) |
| M | 92,89* | 6,73* | 0,30 | 7,03* | 0,11 |
| σ | 1,77 | 1,58 | 0,22 | 1,74 | 0,07 |
| m | 0,67 | 0,60 | 0,08 | 0,66 | 0,03 |
| р3-1 | 0,05 | 0,01 | 0,38 | 0,05 | 0,27 |
| 4-я группа (20% витаминов + ПВ) |
| M | 92,60* | 6,73* | 0,53 | 7,26* | 0,17 |
| σ | 1,17 | 1,01 | 0,49 | 1,13 | 0,11 |
| m | 0,44 | 0,38 | 0,18 | 0,43 | 0,04 |
| р4-1 | 0,02 | 0,01 | 0,96 | 0,02 | 0,54 |
| р4-2 | 0,27 | 0,23 | 0,94 | 0,26 | 0,82 |
| р4-3 | 0,72 | 1,00 | 0,29 | 0,77 | 0,27 |
| 5-я группа (20% витаминов + 80% витаминов) |
| M | 91,71* | 7,71* | 0,33 | 8,04* | 0,21 |
| σ | 1,56 | 1,50 | 0,19 | 1,66 | 0,20 |
| m | 0,59 | 0,57 | 0,07 | 0,63 | 0,07 |
| р5-1 | 0,01 | 0,01 | 0,44 | 0,01 | 0,82 |
| р5-3 | 0,21 | 0,25 | 0,8 | 0,28 | 0,24 |
| 6-я группа (20% витаминов + ПВ + 80% витаминов) |
| M | 91,87* | 7,63* | 0,38 | 8,02* | 0,12 |
| σ | 2,20 | 1,97 | 0,21 | 2,18 | 0,10 |
| m | 0,90 | 0,80 | 0,09 | 0,89 | 0,04 |
| р6-1 | 0,02 | 0,01 | 0,59 | 0,02 | 0,29 |
| р6-2 | 0,45 | 0,10 | 0,38 | 0,16 | 0,53 |
| р6-4 | 0,48 | 0,34 | 0,49 | 0,46 | 0,36 |
|
|
|
|
|
|
|
Примечание. * - статистически достоверная разница показателей (р<0,05).
Обозначения: неапоптозные клетки - AnV-FITC-/7-AАD-; ранний апоптоз - AnV-FITC+/7-AAD-; поздний апоптоз - AnV-FITC+/7-AAD+; мертвые клетки - AnV-FITC-/7-AAD+.
Как следует из данных, представленных в табл. 1, добавление в стандартный рацион ПВ (2-я группа) в количестве, соответствующем верхнему допустимому уровню потребления, инициирует развитие раннего апоптоза гепатоцитов: количество клеток имело тенденцию к увеличению на 24,9% (р=0,10) по сравнению с показателем в контрольной группе. Суммарное число клеток в апоптозе у крыс 2-й группы на 22% превышает данный показатель у крыс контрольной группы, хотя различия не достигают уровня достоверной значимости. По-видимому, инициация апоптоза гепатоцитов является следствием воздействия КЦЖК, образующихся при ферментации ПВ кишечной микрофлорой в толстой кишке. Установлено, что потребление ПВ в дозах, соответствующих верхнему допустимому уровню потребления, может нарушать витаминный и минеральный баланс в организме [5, 10]. Длительное и избыточное их поступление с пищей может снижать всасывание и изменять метаболизм витаминов, макро- и микроэлементов. В нашем эксперименте обогащение полноценного рациона привело к статистически достоверно сниженному на 16% (р=0,006) содержанию витамина Е и повышенному на 15% уровню витамина В1 в печени крыс 2-й группы по сравнению с показателем контрольной группы, однако не повлияло на уровень витаминов А и В2 в печени (табл. 2).
Таблица 2. Содержание витаминов в печени крыс
| Группа | Витамин А (пальмитат ретинола), мкг РЭ/г | Витамин Е (альфа-токоферол), мкг/г | Витамин В1, мкг/г | Витамин В2, мкг/г |
| 1-я группа, контроль (100% витаминов) | 22,1±1,4 | 36,1±1,3 | 8,71±0,31 | 30,3±0,5 |
| 2-я группа (100% витаминов + ПВ) | 20,0±0,6 | 30,2±1,5 к | 10,02±0,48 к | 32,5±0,9 |
| 3-я группа (20% витаминов) | 0,88±0,27к | 18,0±1,1 к | 3,81±0,47 к | 18,8±0,7 к |
| 4-я группа (20% витаминов + ПВ) | 0,36±0,09 к, ко | 22,0±0,5 к, ко, д | 3,33±0,27 к, ко | 17,6±0,7 к, ко |
| 5-я группа (20% витаминов + 80% витаминов) | 1,7±0,2 к, д | 56,9±8,2 к, д | 5,09±0,60 к | 25,5±1,5 к, д |
| 6-я группа (20% витаминов + ПВ + 80% витаминов) | 2,7±0,3 о, к, ко, до | 31,5±2,5 о, до | 6,53±0,74 к, ко, до | 27,4±1,2 ко, до |
Примечание. к - достоверное отличие от соответствующего показателя контрольной группы крыс (К), д - от группы крыс с дефицитом витаминов в рационе (Д), ко и до - от групп крыс, получавших полноценный и дефицитный по витаминам корм, обогащенный отрубями (КО и ДО), о - от группы Д + 80%.
Потребление крысами витаминодефицитных рационов (3-я и 4-я группы) обусловило инициацию апоптоза гепатоцитов, статистически достоверно превышающего по величине показатели у крыс контрольной группы (1-я группа) на 33,6% (р=0,010). При сравнении показателей апоптоза у группы, потреблявшей полноценный рацион, обогащенный ПВ (2-я группа), с показателями соответствующей дефицитной группы (4-я группа), статистически достоверной разницы не выявлено. 5-кратное уменьшение количества витаминной смеси в рационе крыс привело к развитию у них глубокого дефицита всех витаминов, что согласуется с ранее полученными данными [4]. Так, содержание в печени крыс 3-й группы витамина В1 уменьшилось в 2,3 раза, В2 - в 1,6 раз, витамина А - в 25 раз, витамина Е - в 2 раза. Обогащение витаминодефицитного рациона крыс 4-й группы ПВ не привело к статистически достоверному изменению содержания в печени исследованных витаминов по сравнению с показателями у крыс 3-й группы, за исключением витамина Е, уровень которого был выше на 22% (р=0,011). Последнее, очевидно, является следствием повышения поедаемости обогащенного отрубями корма, в состав которого входило подсолнечное масло, источник витамина Е. Содержание витаминов в печени оставалось достоверно снижено по сравнению с их уровнем у крыс 1-й и 2-й групп. Поскольку обогащение витаминодефицитного рациона ПВ (4-я группа) не повлияло на степень апоптоза гепатоцитов крыс, можно предположить, что основную патогенетическую роль в инициации апоптоза гепатоцитов играет поливитаминная недостаточность.
Компенсация дефицита витаминов (дополнительное введение 80% витаминов от их содержания в рационе контрольной группы) в рационах крыс в течение 5 сут не повлияла на выраженность процесса апоптоза гепатоцитов независимо от наличия или отсутствия ПВ (5-я и 6-я группы). Содержание витаминов группы В и витамина А в печени у крыс 5-й группы, хотя и повысилось по сравнению с таковым у крыс 3-й группы, оставалось статистически достоверно ниже их содержания у крыс контрольной группы на 16-42% и 92% соответственно. Содержание витамина Е в печени крыс 5-й группы, напротив, статистически достоверно превысило его содержание у крыс контрольной группы на 58% (р=0,028). Компенсация витаминной недостаточности у крыс 6-й группы, находившихся на обогащенном ПВ рационе, привела к более выраженному достоверному повышению содержания витаминов группы В и витамина А в печени крыс и отсутствию статистически достоверной разницы содержания витамина В2 с показателем контрольной группы. Напротив, содержание витамина Е в печени крыс 6-й группы было статистически достоверно ниже данного показателя у крыс 5-й группы - на 81% (р=0,013) и достоверно не отличалось от параметра контрольной группы, что, возможно, является следствием снижения под действием ПВ всасывания витамина Е [13].
Таким образом, в результате исследований установлено, что алиментарная поливитаминная недостаточность играет определенную патогенетическую роль в инициации апоптоза гепатоцитов. При обогащении полноценного рациона крыс ПВ в дозировке, соответствующей верхнему допустимому уровню потребления, обнаружена тенденция к развитию апоптоза гепатоцитов, что может быть результатом как прямого действия образующихся из ПВ КЦЖК, так и ухудшения обеспеченности витаминами, как это было показано ранее [2].
Сведения об авторах
ФГБУ "НИИ питания" РАМН (Москва):
Трушина Элеонора Николаевна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии
E-mail: trushina@ion.ru
Мустафина Оксана Константиновна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии
E-mail: mustafina@ion.ru
Бекетова Нина Алексеевна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ
E-mail: beketova@ion.ru
Вржесинская Оксана Александровна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ
E-mail: vr.oksana@yandex.ru
Коденцова Вера Митрофановна - доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией витаминов и минеральных веществ
E-mail: kodentsova@ion.ru