Открытие интерферона и его клиническое применение

Инфекц. бол.: новости, мнения, обучение. 2017. № 1. С. 23-31.

Задолго до обнаружения интерферона (ИФН) было из­вестно явление интерференции (взаимного подавле­ния) вирусов, заключающееся в невосприимчивости животных, инфицированных вирусом одного типа, к вирусам другого типа. Природа данного феномена долго оставалась не выясненной.

Вечером 6 ноября 1956 г. английский вирусолог Алик Айзекс, занимавшийся изучением феномена вирусной интер­ференции, записал в своем блокноте необычную фразу: "в поисках интерферона". Этим шутливым словом, при­думанным швейцарским ученым Жаном Линдеманном, со­автором открытия эндогенного фактора противовирусной защиты, начинается первая глава в истории изучения и кли­нического применения основного противовирусного сред­ства современности [1].

В 1957 г. в журнале "Proceedings of the Royal Society" Алик Айзекс и Жан Линдеманн опубликовали две статьи, по­священные открытию и изучению белка ИФН [2, 3]. Авторы описывали ИФН как "белок, значительно меньший, чем им­муноглобулины, который производится клетками различных видов животных после заражения живыми или инактивированными вирусами; способный ингибировать рост разно­образных вирусов в клетках тех же видов животных, в дозах, нетоксичных для клеток".

Эти работы открыли эру ИФН. Человечество обрело мощное естественное средство в борьбе с вирусными ин­фекциями. Важность открытия подтверждается тем, что уже в 1959 г. для координации научной программы исследова­ний был образован Научный комитет по интерферону (да­лее - Комитет), который возглавил Алик Айзекс. Комитет сфокусировал свои задачи на развитии методов продукции ИФН и его очистки. В первую очередь Комитет сосредо­точился на проблеме видоспецифичности в связи с не­обходимостью получения препарата ИФН, пригодного для человека.

Из соображений видового сходства приматов первое испытание на добровольцах было предпринято с ИФН, по­лученным на клетках обезьян. В июне 1960 г. Д.А. Тиррелл информировал Комитет о проведении эксперимента с обезь­яньим ИФН на добровольцах из числа сотрудников своей лаборатории. За несколько дней до заседания Комитета сам Тиррелл, а также отдельные члены комитета ввели себе интраназально небольшое количество обезьяньего ИФН. Не­посредственно перед заседанием участников эксперимента заразили вирусом Коксаки, вызывающим простуду. Через несколько месяцев Д.А. Тиррелл доложил: несмотря на то, что в назальных смывах у всех участников эксперимента был выявлен вирус возбудителя, заболел только он один. При этом побочные эффекты действия ИФН обнаружены не были.

На основании полученных данных члены Комитета одо­брили проведение официальных испытаний ИФН на до­бровольцах. Результаты испытаний были опубликованы в журнале "Lancet" в апреле 1962 г., где был показан адъювантный эффект ИФН при вакцинации [4].

За прошедшее с момента открытия ИФН время были обнаружены и изучены различные белки ИФН. В орга­низме человека их вырабатывается около 20 видов - це­лое семейство. В начале 1960-х гг. ИФН классифициро­вали по клеткам-продуцентам: лейкоцитарный (ИФН-α), фибробластный (ИФН-β) и иммунный (ИФН-γ). На сего­дняшний день ИФН подразделяют по принципу иммуногенных свойств и отличий в генных последовательно­стях, которые кодируют разные популяции молекул ИФН. В зависимости от этих признаков, а также от физико-химических характеристик, механизма действия и на осно­вании ряда других факторов ИФН подразделяют на 3 типа - I, II, III.

ИФН I типа (α, β, ω, ε) продуцируются и секретируются большинством клеток организма в ответ на действие вирусов и некоторых других агентов. К ИФН II типа относится ИФН-γ, который продуцируется клетками иммунной системы в ответ на действие чужеродных агентов. К III типу отно­сится недавно открытый ИФН-λ.

С медицинской точки зрения наиболее важна противо­вирусная функция ИФН I типа. Механизм их действия схема­тически представлен на рис. 1.

Лейкоцитарный интерферон: лечение и профилактика вирусных заболеваний

Вначале в медицинскую практику нашей страны были внедрены природные ИФН-α, вырабатываемые лейкоци­тами.

Широкое применение человеческого лейкоцитар­ного ИФН в лечебных и профилактических целях началось в СССР в конце 1960-х гг. под руководством В.Д. Соловьева, предложившего оригинальную технологию производ­ства препарата на лейкоцитах плацентарной крови, со­биравшейся от родильниц в отдельных городах страны. Продукцию ИФН в лейкоцитах стимулировали вирусом Ньюкасл [6].

Во время эпидемии гриппа Гонконг в Советском Союзе в 1969 г. провели успешное испытание человеческого лейкоцитарного ИФН. В исследованиях приняли участие 14 тыс. человек разных возрастных групп. При интраназальном введении препарата (в дозе 128 ЕД 5 раз в день в течение 5 дней) его эффективность варьировалась от 56,3 до 69,2%, в зависимости от возраста участников [7].

В период эпидемии гриппа в 1973 г., когда в одной только Москве регистрировалось в день до 90 тыс. заболеваний, применение в школах человеческого лейкоцитарного ИФН (интраназально по 500 ЕД в течение 3 дней) значительно снизило заболеваемость и уменьшило симптомы вирусной инфекции [8].

Исследования по лечебному применению ИФН под ру­ководством академика А.А. Смородинцева в 1971-1975 гг. показали улучшение клинического состояния больных гриппом типа В при введении 1000 ЕД ИФН интраназально в виде капель. Одновременно с этим было отмечено бо­лее эффективное использование данного препарата по­средством интраназального распыления. Применение лейкоцитарного ИФН с низкой активностью (32 ЕД/мл) в лечебно-профилактических целях позволило снизить за­болеваемость детей в 3,9 раза по сравнению с контрольной группой, получавшей плацебо. Кроме того, было отмечено, что в 14 детских учреждениях, где применяли ИФН, наблю­далось более быстрое купирование вспышек гриппа по сравнению с двумя контрольными учреждениями, где ИФН не применяли [9].

Таким образом, к началу 1990-х гг. в СССР был накоплен значительный опыт местного применения человеческого лейкоцитарного ИФН для профилактики и лечения респира­торных заболеваний, гриппа и некоторых других вирусных инфекций. Эффективность применения лейкоцитарного ИФН для профилактики гриппа в СССР получила высокую оценку во всем мире. Для ознакомления с этим передовым опытом Советский Союз посетила группа английских и американских ученых по линии Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [8].

Впоследствии данный опыт применили английские врачи, специалисты из Болгарии и Японии. Так, значитель­ный успех терапевтического и профилактического дей­ствия лейкоцитарного ИФН в низкой дозе 160 ЕД, вводи­мого интраназально от 3 до 5 раз в день в течение 3 дней, продемонстрировали болгарские исследователи в 1976 г. Эффективность защиты от вирусных инфекций у детей до­школьного возраста (включая новорожденных), принимав­ших препарат, достигала 85,2% [10].

Противовирусный эффект человеческого лейкоцитар­ного ИФН также был продемонстрирован на добровольцах в Великобритании в отношении риновирусной инфекции в 1977 г. [11] и в США в отношении вируса везикулярного стоматита в 1978 г. [12].

Высокая профилактическая активность лейкоцитарного ИФН в отношении простудных заболеваний была показана японскими исследователями в 1980-1985 гг., изучавшими низкие дозы лейкоцитарного ИФН при интраназальном при­менении (от 5000 до 50 000 ЕД) в профилактике респиратор­ных заболеваний и гриппа [13-15].

Однако одним из препятствий для дальнейшего широкого внедрения ИФН в клиническую практику становится отсут­ствие их стандартизации и единых методов контроля каче­ства, в том числе определения биологической активности (противовирусной, антипролиферативной, иммуномодулирующей). Сравнивать результаты клинического применения препаратов ИФН, полученных в различных странах, было за­труднительно, поскольку каждая страна для производства ИФН использовала собственные методики и собственные способы оценки его качества и активности, отличные от раз­работанных в других странах.

Стандартизация препаратов интерферона

Как уже отмечалось, для клинических исследований чрезвычайно важно, чтобы дозировка используемых препа­ратов была сопоставима. Таким образом, возникла необхо­димость создать международные стандарты ИФН.

Национальные референсные образцы человеческого лейкоцитарного ИФН были разработаны к 1969 г. в Нацио­нальном институте биологических стандартов и контроля (Великобритания), Национальном институте аллергии и ин­фекционных заболеваний (США) и Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (СССР/Россия).

В 1978 г. ВОЗ выпустила меморандум, обобщивший на­копленный мировой опыт по производству, контролю каче­ства и клиническому применению ИФН. В меморандуме было сформулировано требование о необходимости стандартиза­ции препаратов ИФН [16].

Разработкой международных стандартов занялись 93 лаборатории из 29 стран мира. 15 различных препаратов ИФН-α были исследованы на противовирусную и антипро-лиферативную активность. Полученные результаты предста­вили в NIBSC для обобщения и сравнения. Поскольку самым важным тестом для характеристики всех ИФН является опре­деление их противовирусной активности, для ее сравнения в 1999 г. на 50-й сессии Экспертного комитета по биологи­ческой стандартизации ВОЗ (The WHO Expert Committee on Biological Standardization, ECBS) был принят первый между­народный референс-препарат биологической активности (1^st International Reference Preparation, IRP). Одна ампула стандарта IRP содержала человеческий лейкоцитарный ИФН с суммарной активностью 11 000 международных единиц (ME). На той же сессии были приняты стандарты и для дру­гих ИФН, в том числе человеческого рекомбинантного ИФН альфа-2b [Interferon alpha-2b, human, recombinant, rHulFN-alpha2 (alpha-2b)] с активностью 70 000 ME/амп. Оба референс-препарата ВОЗ хранятся в NIBSC и используются по на­стоящее время [17, 18].

Необходимость создания двух стандартов биологиче­ской активности ИФН была продиктована тем, что к этому времени помимо природных лейкоцитарных ИФН были раз­работаны препараты на основе рекомбинантных технологий.

Рекомбинантный интерферон: новые возможности терапии и профилактики

Препараты человеческого лейкоцитарного ИФН пред­ставляют совокупность ИФН-α, а также других белков-цитокинов, синтезируемых лейкоцитами донорской крови в ответ на воздействие вируса-интерфероногена. Это объясняет его высокую клиническую эффективность.

Стоит, однако, учитывать, что состав препарата челове­ческого лейкоцитарного ИФН непостоянен даже у одного производителя. К недостаткам препаратов ИФН, полученных из крови человека, помимо неоднородности состава, отно­сится также низкая степень очистки, в том числе от вирус­ных частиц - индукторов синтеза ИФН. Кроме того, нельзя не отметить высокую себестоимость таких препаратов и не­возможность их парентерального применения. В настоящее время препараты лейкоцитарного ИФН используют строго по жизненным показаниям, когда ожидаемая польза превышает возможный риск.

Получение методами генной инженерии препаратов человеческого ИФН-α в бактериальных клетках позволило преодолеть все вышеназванные проблемы и получать особо чистый однородный рекомбинантный белок ИФН, идентич­ный природному по аминокислотному составу, в больших количествах и по относительно низкой себестоимости.

Разработка технологий производства рекомбинантного ИФН-α во многих странах, в том числе в СССР, создала воз­можность реализовать его противовирусную и антипролиферативную активность там, где требуются длительные курсы с парентеральным введением высоких доз, что было недо­стижимо с человеческим лейкоцитарным ИФН. Наиболее широкое применение инъекционные препараты рекомбинантного ИФН нашли при лечении вирусных гепатитов и онкологических заболеваний.

После создания отечественного рекомбинантного ИФН альфа-2Ь в СССР (1986-1990 гг.) были проведены кли­нические испытания и внедрение в медицинскую практику новых лекарственных препаратов на основе рекомбинантного ИФН. Испытания проводились не только для традици­онной инъекционной формы, но и для других лекарственных форм, таких как мази, таблетки для профилактики вирусной и бактериально-вирусной диареи, суппозитории[19-21].

Препараты местного применения на основе рекомбинантного интерферона альфа

Необходимо подчеркнуть, что лишь в СССР, а затем в Рос­сийской Федерации продолжились работы по расширению спектра ИФН-содержащих препаратов для местного при­менения. Была проведена поистине масштабная работа, поскольку переход от лейкоцитарного к рекомбинантному ИФН потребовал заново провести подбор эффективных доз в препаратах для местного назначения.

Использование рекомбинантного ИФН-α в высоких до­зах для профилактики и лечения респираторных вирусных инфекций не получило в мире широкого развития из-за не­желательных реакций при местном применении ИФН. Боль­шинство побочных эффектов, связанных с использованием высокодозных интраназальных препаратов с ИФН, прояв­лялось заложенностью, кровоточивостью и подсушиванием слизистой оболочки носа, а также образованием на ней эро­зий и язв [22].

Российский опыт интраназального применения ИФН-α в профилактических целях позволяет считать, что дозы 1 000 000 МЕ/мл опасны, поскольку вызывают нежелательные реакции. Наибо­лее приемлемы и безопасны для профилактики респиратор­ных вирусных заболеваний дозы от 10 000 до 100 000 МЕ/мл.

Установлено, что физиологические уровни эндогенных ИФН I типа во время вирусных инфекций колеблются между 116-138 МЕ/мл в смывах из носовой полости и только 10-30 МЕ/мл в сыворотке крови [23, 24]. Механизм дей­ствия относительно малых доз ИФН при профилактике ре­спираторных инфекций и гриппа изучен недостаточно. Тем не менее можно предположить, что ИФН I типа, выделяе­мые в физиологических концентрациях клетками эндоте­лия дыхательного тракта, могут способствовать противови­русной защите этих клеток без формирования адаптивного иммунного ответа, для которого требуется значительно большее количество ИФН. Это позволяет сделать вывод о том, что в случае опасности заражения гриппом и дру­гими ОРВИ при выраженном недостатке эндогенных ИФН необходимо применять экзогенные ИФН - в дозах, до­статочных для предотвращения заболеваний вирусными инфекциями.

Опираясь на опыт клинического применения ИФН в России, недавние исследования китайских и американских авторов воз­родили интерес к профилактическому использованию местных форм ИФН-α [25-27]. Применение назального спрея, содержа­щего 9х10⁵ МЕ человеческого рекомбинантного ИФН альфа-2b позволило снизить заболеваемость среди новобранцев китай­ской армии от инфекций, вызываемых вирусами гриппа А и В, парагриппа 1-3-го типа и аденовируса типа В [25, 26].

В настоящее время благодаря большому опыту практи­ческого применения ИФН Россия занимает лидирующие по­зиции в области разработки и клинического использования местных форм препаратов ИФН.

Одной из ведущих российских компаний по производ­ству ИФН-содержащих препаратов местного применения является биотехнологическая компания ФИРН М. Специ­алистами компании разработана широкая гамма новых лекарственных форм рекомбинантного ИФН альфа-2b на основании собственного многолетнего опыта использо­вания человеческого ИФН и проведенного анализа эф­фективности относительно малых доз этого препарата для профилактики и лечения острых респираторных вирус­ных инфекций (ОРВИ) и гриппа. Самым известным и наи­более доступным лекарственным препаратом является Гриппферон®. Препарат выпускается в форме назальных капель и спрея. Гриппферон® действует в месте первич­ного внедрения и размножения респираторных вирусов -в эпителиальных клетках слизистой оболочки носа. Специ­альные полиэлектролитные добавки, широко применяемые в медицине, обеспечивают надежную фиксацию препарата на слизистой оболочке носа и способствуют уменьшению ее отека [28].

Использование рекомбинантного ИФН вместо природ­ного позволило решить несколько задач: преодолеть дефи­цит естественного сырья (крови) для производства; умень­шить стоимость конечного продукта; обеспечить полную безопасность препарата с точки зрения контаминации виру­сами гемоконтактных гепатитов, цитомегаловирусом (ЦМВ), вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и др.

Гриппферон® не имеет аналогов в мире. Его приоритет подтвержден патентом на международном уровне. Попытки создать препарат подобного рода предпринимались учеными на протяжении многих лет. Основная трудность заключалась в обеспечении стабильности свойств ИФН в растворе. Рос­сийским ученым удалось разрешить эту непростую задачу.

Благодаря оптимально подобранному физико-химиче­скому составу препарата удалось добиться четкой стабиль­ности свойств ИФН в растворе в течение 2 лет и обеспечить продолжительный контакт ИФН со слизистой носовой поло­сти. Интраназальное использование препарата позволило создать мощный барьер непосредственно в месте первич­ного внедрения и размножения вирусов, передающихся воз­душно-капельным путем.

Стоит отметить, что при местном использовании пре­парата, в отличие от парентерального введения, не образу­ются антитела, нейтрализующие антивирусную активность рекомбинантного ИФН альфа-2^ В отличие от препаратов для парентерального введения Гриппферон® не вызывает побочного действия, к нему не развиваются привыкание и резистентность [29].

Успешный многолетний опыт эффективного приме­нения Гриппферона для профилактики и лечения гриппа и других ОРВИ у взрослых и детей с рождения [30-32] послу­жил отправной точкой для создания новых комбинированных препаратов на основе рекомбинантного ИФН. Так, мазевая форма генно-инженерного ИФН альфа-2b (Герпферон®) пред­назначена для терапии герпетической инфекции кожи и сли­зистых. В ее состав для усиления лечебного эффекта были введены фармакологические средства с целенаправленным механизмом действия: ацикловир и лидокаин. Глазные капли рекомбинантного ИФН и антигистаминного компонента ди­медрола (Офтальмоферон®) широко применяются в офталь­мологии при лечении глазных заболеваний вирусной этио­логии. Представляет интерес комбинация ИФН и лоратадина (Аллергоферон®) для лечения аллергического ринита и конъюнктивита [33]. В повседневную гинекологическую практику активно внедряются вагинальные суппозитории с содержанием рекомбинантного ИФН, метронидазола и флуконазола (Вагиферон®) для лечения дисбиотических нарушений и инфекционных заболеваний женской половой сферы.

Следует особо подчеркнуть, что все готовые лекарствен­ные формы производятся на собственном производстве ком­пании ФИРН М, аттестованном на соответствие правилам Над­лежащей производственной практики (ГОСТ Р 52249-2009) и имеющем систему менеджмента качества, соответствующую требованиям ГОСТ ISO 9001-2011 (ISO 9001:2008). Эффектив­ность и безопасность всех выпускаемых препаратов доказана клиническими исследованиями, а также многолетним опытом пострегистрационного применения.

Сведения об авторах

Лев Александрович Денисов

Cтепень/зв.: доктор медицинских наук, профессор

Должность: советник по научным вопросам

Место работы: Биотехнологическая компания ЗАО "Фирн М", Москва

e-mail: firnm@grippferon.ru

Игорь Владимирович Шолохов

Должность: научный консультант

Место работы: Биотехнологическая компания ЗАО "Фирн М", Москва